nightsea熒光適配器觀測綠色熒光時濾光片的選擇

更新時間：2015-05-15

技術文章

觀察GFP和包括FITC在內的綠色熒光，都可以使用nightsea的體視顯微鏡熒光適配器(Stereo Microscope Fluorescence Adapter)，這毫無問題。我們經常遇到的問題是：是用下圖中黃色的longpass濾光片好呢？還是選擇綠色的bandpass濾光片好。

答案是：不能一概而論，常要視具體情況來做出選擇。下文分析一下兩者各自的優缺點。

Longpass：可以透過任何超過~500nm波長的光

Bandpass：透光波長以~530nm為中心，透光波長范圍約~60nm。

就是說bandpass只能透過綠色光，而longpass可以透過的光包括了綠，黃，橙和紅色。

濾光片有何作用？

濾光片就是用來強化預觀察的熒光信號的：它能擋住(源于激發光源的)反射光，同時透過我們想觀察的熒光信號。在實際觀察中常常受到來自觀測區域內其它潛在熒光信號的干擾（噪音），這類背景熒光信號可能來自培養基（線蟲研究中常會有此問題），或是其它東西（例如植物葉綠素和發育中的斑馬魚的yolk發出的熒光信號）。

Longpass和bandpass在阻擋激發光上都沒有問題。問題焦點是面對這些噪音信號，兩者中哪個才是正確的選項？

如果背景信號和你要觀察的信號在波長上不存在重疊，那應該選擇bandpass濾光片。如下圖所示，擬南芥（或其它植物）的葉綠素發出紅色熒光，其波長峰值約為685 nm，bandpass可以將它過濾掉，這樣就可以輕松觀察GFP信號而不再受到它的干擾（*張顯示longpass濾光片下存在信號疊加，第二張bandpass下只余下綠色熒光）。

擬南芥圖片由波士頓大學John Celenza博士惠贈。

更多圖片鏈接：http://www.nightsea。。ｃｏｍ/articles/green-bandpass/

但是，在所要觀察的熒光信號與背景信號波長存在交叉疊加時，將背景信號過濾掉則可能引起問題。這時，使用longpass濾光片保留背景信號更好：可以通過信號的強度和顏色的對比來區分（哪是要觀察的熒光信號，哪是背景信號）。下面是一條轉熒光基因的斑馬魚圖片。這條斑馬魚在心臟表達GFP，在血細胞表達mCherry。Longpass（上端）就可以將此區分出來，而bandpass（下端）就不能。上端圖像可以呈現出清晰的綠色熒光心臟，紅色熒光血細胞，還有yolk天然發出的黃色熒光。而在選擇bandpass濾光片所獲的圖像里，滿眼是強弱不等的綠色，這些綠色并不全是來自GFP的表達，因此容易造成混亂和誤判。